|
|
Role of the WIP1 phosphatase in the nucleolus
Palková, Natálie ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
Protein fosfatáza 2C delta (známá jako WIP1) je důležitým negativním regulátorem signalizace odpovědi buňky na poškození DNA (DDR). Jako protein vázaný na chromatin defosforyluje, a tedy inaktivuje ATM kinázu a transkripční faktor p53. Zvýšená exprese WIP1 potlačuje funkci tumour supresoru p53 a přispívá k rozvoji řady nádorových onemocnění včetně nádorů prsu a mozku. V posledních letech bylo ukázáno, že WIP1 může regulovat rovněž buněčné procesy, které nejsou přímo spojeny s DDR, jako je například zajištění stability telomer. Alternativní funkce proteinu WIP1 však nebyly dosud plně pochopeny. V této práci jsme popsali novou roli proteinu WIP1 v jadérku, organele zodpovědné za produkci ribozomů. Zjistili jsme, že WIP1 asociuje s mnoha jadérkovými proteiny, a pomocí delečních mutant jsme identifikovali jadérkovou lokalizační sekvenci (NoLS) na C-konci proteinu. Pomocí super-rezoluční mikroskopie jsme identifikovali lokalizaci WIP1 fosfatázy ve fibrilárních centrech jadérka . Za použití inducibilního Cas9 systému pro generování dvouřetězcových zlomů v rDNA jsme dále zjistili, že WIP1 ovlivňuje akumulaci faktorů zajišťujících opravu poškození DNA. Analýza založená na kvantitativní mikroskopii ukázala, že aktivita WIP1 má vliv také morfologii jadérka. Na základě našich výsledků usuzujeme, že WIP1...
|
|
|
The role of truncated PPM1D/Wip1 phosphatase in cancer
Martiníková, Andra-Stefania ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Mistrík, Martin (oponent)
Poškození DNA v buňkách spouští aktivaci buněčne signální dráhy odpovědi na poškození DNA (DDR) do opravení DNA se tak zastaví buněčný cyklus. Opětovné zahájení buněčného cyklu je zahájeno pomocí PPM1D/WIP1 fosfatázy, která po opravení poškození defosforyluje markery poškození DNA. DDR tak brání nestabilitě genomu nebo vývoji rakoviny. Mutace genu Ppm1d pak působí vysoce stabilní zkrácený protein, který je pozorován jak u onkologických pacientů, tak i v rakovinných buněčných liniích. V této dizertační práci jsme využili model transgenní myši, ve které vedly mutace exonu 6 genu Ppm1d k expresi zkrácené varianty PPM1D proteinu. U myší se zkraceným PPM1D v brzlíku/thymu (Ppm1dT/+ ) byly pozorovány jak vysoké hladiny PPM1D proteinu, tak i snížená aktivace dráhy DDR po vystavení IR. Následně byly Ppm1dT/+ myši kříženy s Trp53+/- heterozygotními knock-out myšmi, které jsou náchylné k thymickému lymfomu. Získaní Ppm1dT/+ Trp53+/- dvojití mutanti měli po IR zvýšenou frekvenci T-buněčných lymfomů ve srovnání s mutanty pouze v Trp53+/- . Následně bylo pozorováno, že zkrácená varianta PPM1D vede k defektům aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu v lidských netransformovaných RPE buňkách, které pokračují v proliferaci navzdory přítomnému poškození DNA. Po vystavení buněk RPE1 replikačnímu stresu byla...
|
|
|
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Pecháčková, Soňa ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Krejčí, Lumír (oponent)
(Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D,...
|
|
|
In search of DUSP specificity
Sladeček, Stanislava ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Martínková, Natália (oponent)
Duálně specifické fosfatázy (DUSP) jsou enzymy, které defosforylují fosfoserinové/threoninové a fosfotryrozínové zbytky na jednom substrátu. Většina z nich specificky defosforyluje rodinu mitogeny-aktivovaných protein kináz (MAPK). Počet DUSPů se zvyšuje u složitějších organismů a v lidském genomu je 25 popsaných DUSPů. Některé DUSPy mohou defosforylovat pouze jeden protein, zatímco jiné interagují s širším spektrem substrátů. S výjimkou substrátové specificity se DUSPy liší v expresii, subcelulární lokalizaci atd. Přestože byly první DUSPy popsány asi před 20 lety, doposud není popsaný žádný zřejmý faktor zodpovědný za jejich substrátovou specifitu. Předložená diplomová práce se snaží použitím in silico metod objasnit a popsat společné vlastnosti a rozdíly DUSPů, které mohou být důležité pro určování jejich specificity. Klíčová slova: fosfatázy, kinázy, DUSP, MAPK, substrátová specificita, konzervovanost aminokyselinových zbytků, fylogenetický strom, in silico metody
|
|
|
Charakterizace fosfatas v rostlinách tabáku (Nicotiana tabacum L.)
Růžičková, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Fosfatasy (EC 3.1.3.x) jsou skupina enzymů, které hydrolyzují fosfoestery. Významně tak ovlivňují energetický metabolismus buňky i jeho regulaci. Fosfatasy defosforylující proteiny jsou nedílnou součástí signálních drah a odpovědí na stres a regulují enzymy. Tato práce se věnuje studiu fosfatas získaných z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.). Byly připraveny enzymové preparáty kyselou i zásaditou extrakcí. Za použití chromogenního substrátu pNP-fosfátu byla zjištěna vyšší fosfatasová aktivita glykosylované frakce než ve frakci nezachycené na Con A Sepharose. Studium vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu zaznamenalo aktivaci ionty Mg2+ a Ca2+ a inhibici ionty Co2+ a Mn2+. Zn2+ ionty fosfatasovou aktivitu neovlivňovaly. Glykosylované fosfatasy štěpily rovněž další nízkomolekulární substráty fosfoserin, ATP a glukosa-6-P. Při studiu proteinfosfatasové aktivity bylo zjištěno, že substrátem glykosylované frakce fosfatas je fosvitin, ale ne kasein ani tryptické štěpy kaseinu. Podrobným měřením bylo zjištěno, že pH optimum pro všechny substráty leží v oblasti pH 5-6. Glykosylované fosfatasy štěpí také fosfát v molekule PEPC ze semen kukuřice.
|
|
|
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Pecháčková, Soňa ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Krejčí, Lumír (oponent)
(Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D,...
|
|
|
In search of DUSP specificity
Sladeček, Stanislava ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Martínková, Natália (oponent)
Duálně specifické fosfatázy (DUSP) jsou enzymy, které defosforylují fosfoserinové/threoninové a fosfotryrozínové zbytky na jednom substrátu. Většina z nich specificky defosforyluje rodinu mitogeny-aktivovaných protein kináz (MAPK). Počet DUSPů se zvyšuje u složitějších organismů a v lidském genomu je 25 popsaných DUSPů. Některé DUSPy mohou defosforylovat pouze jeden protein, zatímco jiné interagují s širším spektrem substrátů. S výjimkou substrátové specificity se DUSPy liší v expresii, subcelulární lokalizaci atd. Přestože byly první DUSPy popsány asi před 20 lety, doposud není popsaný žádný zřejmý faktor zodpovědný za jejich substrátovou specifitu. Předložená diplomová práce se snaží použitím in silico metod objasnit a popsat společné vlastnosti a rozdíly DUSPů, které mohou být důležité pro určování jejich specificity. Klíčová slova: fosfatázy, kinázy, DUSP, MAPK, substrátová specificita, konzervovanost aminokyselinových zbytků, fylogenetický strom, in silico metody
|
|
|
Charakterizace fosfatas v rostlinách tabáku (Nicotiana tabacum L.)
Růžičková, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Fosfatasy (EC 3.1.3.x) jsou skupina enzymů, které hydrolyzují fosfoestery. Významně tak ovlivňují energetický metabolismus buňky i jeho regulaci. Fosfatasy defosforylující proteiny jsou nedílnou součástí signálních drah a odpovědí na stres a regulují enzymy. Tato práce se věnuje studiu fosfatas získaných z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.). Byly připraveny enzymové preparáty kyselou i zásaditou extrakcí. Za použití chromogenního substrátu pNP-fosfátu byla zjištěna vyšší fosfatasová aktivita glykosylované frakce než ve frakci nezachycené na Con A Sepharose. Studium vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu zaznamenalo aktivaci ionty Mg2+ a Ca2+ a inhibici ionty Co2+ a Mn2+. Zn2+ ionty fosfatasovou aktivitu neovlivňovaly. Glykosylované fosfatasy štěpily rovněž další nízkomolekulární substráty fosfoserin, ATP a glukosa-6-P. Při studiu proteinfosfatasové aktivity bylo zjištěno, že substrátem glykosylované frakce fosfatas je fosvitin, ale ne kasein ani tryptické štěpy kaseinu. Podrobným měřením bylo zjištěno, že pH optimum pro všechny substráty leží v oblasti pH 5-6. Glykosylované fosfatasy štěpí také fosfát v molekule PEPC ze semen kukuřice.
|
|
| |
host ::
RSS.